Тесты полимеразной цепной реакции сейчас считаются самым эффективным методом выявления коронавирусной инфекции. Сейчас в Украине проводят около 40 тысяч ПЦР-тестов в сутки, а к концу года этот показатель должен вырасти до 75 тысяч. Однако есть случаи, когда пациенты жалуются на симптомы присущие коронавирусу, но получают отрицательные результаты ПЦР-теста.
Ранее главный санитарный врач Виктор Ляшко в интервью «Украинской правде. Жизнь» рассказал, что такое тестирование показывает правильный результат в 70% случаях.
Министр Максим Степанов уточнял, что треть тестирований проведенных методом ПЦР может быть ложной из-за ряда причин: «Это связано с забором материала, физиологическими особенностями организма, с тем, где именно располагается вирус в то время, когда берут мазок для диагностики ПЦР».
Так какие факторы влияют на достоверность ПЦР-теста, и в каких случаях можно получить ложный результат? Ответ на эти вопросы в рамках проекта «Спроси жизнь» нам помогали находить:
Бижан Шаропов, главный биолог «Украинские генетические технологии», один из украинских разработчиков тест-систем;
Елена Ливинская, биолог, основательница научно-популярного ресурса «Микроб и я».
Напомним, в формате AMA (ask me anything) вы можете задать нам любой вопрос, и мы найдем эксперта, который на него ответит.
Как работает ПЦР-тест?
«ПЦР-диагностика основана на проведении полимеразно-цепной реакции – это многократное копирование конкретного фрагмента ДНК.
Если исследуемый фрагмент ДНК или РНК присутствует в клиническом материале, то реакция запускается, если отсутствует – не запускается», – рассказывает биолог Елена Ливинская.
Уникальность этого метода в том, что он позволяет из большого количества генетических последовательностей выделить и исследовать ее.
«ПЦР-тест работает таким образом, что выявляет непосредственно генетические последовательности вируса в мазке из слизистых оболочек. Если просто взять мазок из носа, то там будет огромная сумма самых разнообразных микроорганизмов. Также при заборе забирается и собственная ДНК пациента. Метод ПЦР позволяет из этой смеси генетических последовательностей выбрать одну, размножить ее и зафиксировать», – объясняет Бижан Шаропов.
Проведение анализа проходит в несколько циклов. «Циклами происходит размножение ДНК, обычно, их 40. Если человек сильно болен, то пороговое значение появится на 23-25-м цикле», – объясняет ученый.
Как подготовиться к забору материала для ПЦР-теста
Биолог Елена Ливинская замечает, что какие-то физиологические особенности человека не имеют сильного влияния на результат тестирования. Но советует воздержаться от некоторых процедур, чтобы сохранить количество вируса на время тестирования.
«Перед сдачей теста желательно не есть, не пить, не промывать нос или рот, чтобы было больше вирусного материала, если он присутствует», – замечает ученый.
Кроме того, эксперт отметила, что лаборатория может предоставлять собственные рекомендации, опираясь на возможные особенности работы тестов, с которыми они работают.
В Центре общественного здоровья отмечают, что перед прохождением ПЦР-тестирования пациенту не рекомендуется:
За 6 часов до него
Употреблять лекарственные средства для орошения ротоглотки;
Использовать препараты для рассасывания.
За 3-4 часа
Жевать резинку или конфеты;
Чистить зубы, полоскать горло или рот;
Есть или пить;
Курить.
Сдавать тестирование в ЦОЗ также рекомендуют утром – сразу после ночного сна. Елена Ливинская объясняет, это из-за того, что еда и напитки могут влиять на результат.
Как должна проводиться процедура забора материала для ПЦР-теста
Отбирать материал для исследований могут только медицинские работники или представители мобильных бригад. В ЦОЗ создали инструкцию для медицинских работников, как именно они должны проводить эту процедуру. При этом как пациент вы можете убедиться в наличии необходимых средств защиты и оценить насколько профессионально у вас взяли мазок.
Следовательно, медработники во время забора должны использовать следующие средства защиты:
медицинская маска или респиратор класса защиты не ниже FFP2;
защитные очки или щиток для лица;
изоляционный защитный халат и шапочка;
перчатки.
Для отбора биологического материала должны быть:
стерильные тампоны из дакрона или вискозы или универсальные зонды;
шпатель;
транспортный эпендорф со средой;
инструмент для маркировки биологического материала;
направление на лабораторное тестирование;
пакеты для направления и контейнера с биологическим материалом.
Как правильно берется мазок:
Для того чтобы взять мазок из горла нужно медленным движением сделать мазок с задней стенки глотки и миндалин. Тампон или зонд не должен касаться мягкого неба.
Для того чтобы взять мазок из носа, нужно ввести тампон или зонд в ноздрю на 2-3 см, касаясь средней носовой раковины и слизистой оболочки перегородки. Образцы из обеих ноздрей берутся одним тампоном.
Для мазков из зева и носа должны использоваться отдельные тампоны или зонды.
После забора нужно поместить оба тампона, зонд в стерильную пробирку с 2-3 мл транспортной среды вместе с мазком из зева. Прокрутить его до 10 раз, а после – утилизировать.
Также необходимо промаркировать образец. Медработник должен указать на контейнере индивидуальный номер, дату отбора и тип образца.
Важным заключительным этапом проведения забора является своевременная транспортировка образцов в лабораторию для проведения анализа.
Когда тест считается отрицательным
Важно понимать, что достоверность той трети исследований, которые по статистике показывают неправильный результат – это не погрешность теста. В 30% случаев тест показывает отрицательно ложный или положительно ложный результат, из-за влияния разнообразных факторов. Например, это может зависеть от неправильного забора или транспортировки материала.
При этом достоверность самого метода составляет 96-99%.
«Любой молекулярно биологический метод: ИФА, ПЦР, даже МРТ – всегда связан с ошибками. В медицине золотым стандартом считается, что метод, который имеет процент истинно положительных, или истинно отрицательных результатов от 95% до 99%. Нашу тест-систему мы испытывали на такие параметры как специфичность и чувствительность. Замеры показали 96% чувствительности и 99% специфичности», – объясняет Бижан Шаропов.
Он объясняет, что при ПЦР-тесте происходят два процесса:
Амплификация — размножение некой последовательности, когда из двух молекул может образоваться 2 миллиарда.
Детекция — когда флуоресцентная метка, плавающая в пробирке, связывается строго с проточной последовательностью интереса.
«Результат называется отрицательным, когда в образце не было последовательности интереса, и амплификация не прошла. Это все определяется в специальном приборе под названием термоциклер. Обычно туда загружают 96 образцов. Реакция происходит в пробирке, а этот прибор детектирует отсвечивание пробирки и рисует на экране кривую. Если образец отрицательный – кривая получится ровной. Если образец положительный, то происходит размножение ДНК, соответственно, кривая растет», – поясняет эксперт.
Что влияет на достоверность ПЦР-теста
Расположение вируса
Ранее в МИНЗДРАВЕ заявляли, что результат ПЦР-теста может быть ложно отрицательным, когда вирус располагается не в ротоглотке, а нижних частях дыхательных путей.
Ученый Бижан Шаропов отмечает, что такая вероятность есть, однако вирусологи до сих пор спорят по этому вопросу.
«Коронавирус более троплен к эпителию нижних дыхательных путей. Поэтому есть теория, что при заболевании он может действительно в основном размножаться где-то, глубоко в бронхах и легких – а на горе его будет мало, поэтому найти будет трудно. Но есть и противоположная теория – что этот вирус настолько активно размножается, что его даже обнаруживают в моче и кале.
Во время разработки тест-системы, мы очень удивлялись, когда знакомились с документами китайских ученых и Всемирной организации здравоохранения, где моча и кал проходили как разрешенный материал для диагностики коронавируса», – рассказывает ученый.
Елена Ливинская добавляет, что действительно могут быть такие нюансы, но в таком случае наличие вируса можно проверить другим методом.
«Бывают случаи клинической картины пневмоний с применением КТ, а тест ПЦР с верхних дыхательных путей отрицательный. В таком случае может проводиться забор образцов из нижних дыхательных путей, или использование иммунных методов диагностики. Материал из верхних дыхательных путей наиболее информативен в первую неделю от наступления первых симптомов», – отмечает биолог.
Процесс забора материала
Забор материала – один из важнейших факторов, от которого зависит достоверность результата. Он должен проводиться с соблюдением всех санитарных требований. Например, есть случаи, когда во время забора пациентам повреждают слизистую оболочку, из-за чего на мазке остается кровь.
Эксперт Елена Ливинская отмечает, что это также может повлиять на определение результата.
«Если в образце будет присутствовать кровь, то из такого образца может быть немного труднее выделить нуклеиновые кислоты. Но это больше касается экспресс-методик. Если же проводятся полностью все необходимые этапы подготовки образцов к диагностике, то такого быть не должно», – рассказывает она.
Жизнеспособность вируса
Речь идет о жизнеспособности вируса, который остается на мазке во время забора. Бывают случаи, когда пациенты ждут результата своего теста до 5 дней, или и более недели. При этом жизнеспособность вируса на тампоне, ибо зонде является достаточно низкой, поэтому без специальных условий он может просто не дождаться исследования. В таком случае пациент рискует получить ложно отрицательный результат.
«Вирусы – это не полноценные организмы, которые состоят из нескольких молекул и живут с помощью партнеров. Они не способны долго поддерживать свою жизнеспособность. В сухую теплую погоду вирус живет на поверхности 15 минут. Если вирус забрать в раствор – он тоже разрушается, но с меньшей скоростью. При комнатной температуре вирус разрушается сутки — двое», – объясняет Бижан Шаропов.
В Центре общественного здоровья Минздрава отмечают, что максимальный срок хранения назофарингиальных образцов при температуре 4°C – не более 5 суток.
В идеальном случае все мазки из дыхательных путей стоит транспортировать в лабораторию в течение 24-48 часов с момента взятия. Если это сделать невозможно, то образцы нужно заморозить при температуре -70 ° C. При этом количество циклов замораживания и размораживания должно быть минимальным, поскольку это может разрушить вирус в образце.
Транспортировка заборов
Еще одним важным фактором, который не позволяет вирусу потерять свою жизнедеятельность до проведения анализа, является правильная транспортировка образцов в лабораторию.
«На нуклеиновые кислоты вируса могут влиять ферменты, которые могут присутствовать в самом образце. Поэтому образцы помещаются в специальную транспортную среду, которая нивелирует действие этих ферментов», — рассказывает Елена Ливинская.
Что такое транспортные среды и почему они важны, объясняет Бижан Шаропов.
«Транспортные среды – смесь, которая сразу разрушает, разлагает вирус – а с другой стороны защищает его нуклеиновую кислоту от разрушения. В такой транспортной среде вирус может прожить около месяца. Есть еще транспортные среды, которые являются протекторными в отношении вируса – то есть не разрушают и сохраняют его, а наоборот полностью стабилизируют», – поясняет эксперт.
По его словам, нехватка транспортных сред создавала большую проблему в начале эпидемии в Украине.
«Я уверен, что очень много пациентов было пропущено именно из-за того, что не было еще налажено производства транспортных сред у нас в Украине. Тогда вирусы возили просто в физиологическом растворе. И многие ложно отрицательные результаты были получены именно из-за разрушения вируса в образце, пока он выезжал из региональных медучреждений в лаборатории. Сейчас ситуация исправилась, уже есть достаточно транспортных сред», – рассказывает ученый.
Эксперт также замечает, если мазок с вирусом не находится в транспортной среде, то единственный способ его «спасти» – заморозить. При этом есть способ, который позволяет проверить целостность забора, приехавшего в лабораторию – они проходят специальный контроль.
«Для того чтобы понять, что образец нормально доехал из больницы в лабораторию, есть такое понятие как внутренний контроль. Помимо размножения и детекции вирусной частицы, тест-система предполагает размножение обнаружения генома ДНК пациента. Если образец был плохо убран, или сломался по дороге, то будет отрицательный результат по самому вирусу, а также по человеческому геному. Это значит, что в заборе было все разрушено. Все современные тест-системы включают такой внутренний контроль», – объясняет Шаропов.
При этом отмечает, что об отрицательном результате лаборатория имеет право говорить только тогда, когда у нее нет размножения РНК-вируса, но есть размножения человеческой РНК. Значит, здесь сработал внутренний контроль.
Наличие «мертвого» вируса
Кроме ложно отрицательного результата теста во время ПЦР-теста можно также получить ложно положительный результат. Это явление менее распространено, однако может случиться, если в организме остались фрагменты мертвого вируса от инфекции, которая прошла.
«В принципе такая вероятность, может быть, – анализирует ситуацию Бижан Шаропов. — Но один фрагмент вируса анализ не выявит, потому что «золотым стандартом» является детекция от 10 копий. Значит, реакция произойдет, если на мазке будет более 10 вирусов».
Эксперт отмечает, что в научном мире до сих пор продолжается дискуссия по так называемым низкокопейным образцам.
«Если человек серьезно болен, то во время забора на маске остается тысяча молекул вируса. Это означает, что кривая во время анализа вырастет на ранних циклах. При этом большой проблемой до сих пор остаются пациенты, у которых ПЦР обнаруживает присутствие вируса на 38-39 цикле. Тогда не понятно, то ли они выздоравливают, или только немножко заразились, а иммунная система может сама справиться на ранних стадиях», – объясняет ученый.
Один из авторов исследования о ложно положительных тестах, профессор Карл Генега замечает, что невозможно проверить каждый тест на наличие активного вируса, но вероятность ложно положительных результатов можно уменьшить, если ученые могут определить предельную границу.
Сейчас результаты ПЦР-теста приходят в качественном значении – «обнаружено/не обнаружено».
Мы расспросили у нашего эксперта насколько важно количественное значение, как при ИФА-тесте, и возможно ли его сейчас получить.
«Сейчас не принято анализировать эти данные, лаборатория выдает только один результат. Но по собственному опыту мне кажется, что количественное значение ПЦР-теста – важно. Пациенты, у которых в образце обнаруживается малое количество копий вируса, по крайней мере, по моему опыту, гораздо менее заразны, если заразны вообще. Они имеют малую вирусную нагрузку. Мне кажется, что на это нужны дополнительные исследования – стоило бы развиваться в ту сторону», – делится мыслями один из разработчиков тест-систем в Украине.
Период заболевания
Такой метод тестирования может определить наличие вируса на ранних этапах инфицирования. Значит, для проведения ПЦР-тестирования необходимо ждать какого-то этапа заболевания.
«ПЦР позволяет уже через несколько часов после того, как вирус начал размножаться в тканях, детектировать его наличие. Даже до того как начались сами симптомы», – отмечает Бижан Шаропов.
При этом в МИНЗДРАВЕ отмечают, что образцы из верхних и нижних дыхательных путей, собранные в первые дни после появления симптомов, имеют большую диагностическую ценность при выявлении вируса методом ПЦР.
ПЦР-тестирование является более оперативным способом определить вирус, чем тесты иммуноферментного анализа, которые определяют наличие антител.
«ПЦР-тесты считают способом, который быстрее реагирует. Потому что для того, чтобы как следует, проснулся иммунный ответ на любую инфекцию, нужно несколько дней. За это время вирус может спокойно размножаться, после того организм накапливает достаточное количество антител. Поэтому ИФА срабатывает только через несколько дней, после того как инфекция уже началась. Его недостатком, именно в эпидемиологическом аспекте является то, что человек – несколько дней заразен», – объясняет главный биолог.
Автор: Дарья Поперечная
Источник: «УП. Жизнь»
Перевод: BusinessForecast.by
При использовании любых материалов активная индексируемая гиперссылка на сайт BusinessForecast.by обязательна.